昆蟲ELISA試劑盒方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術要求，在檢測過程中除正常反應外，有時常見到一些錯誤的結果。引起昆蟲ELISA試劑盒測定錯誤結果的原因主要有：①標本因素;②試劑因素;③操作因素。下面就一些常見ELISA操作過程中的問題一一分析。
1.樣品稀釋
酶聯免疫反應是一種敏感性很高的反應，如果血清不稀釋，不可避免會產生很強的非特異性反應，出現假陽性。
2.試劑盒平衡
試劑盒中所有試劑和板條均應在試驗前平衡至室溫（約25℃），一般需在室溫放置20——30分鐘以上。平衡時間太短會造成試劑混勻不夠，樣品孵育時間相對縮短，ELISA反應不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。
3.昆蟲ELISA試劑盒樣品和試劑的混勻
稀釋前、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗的均一性。
4.加樣
在現在的ELISA試劑盒中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性
5.溫育
溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui為關鍵的一個因素。
6.洗板
固相免疫測定技術是一種非均相免疫測定技術，需以洗滌操作將特異結合于固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測定的特異性。
7.昆蟲ELISA試劑盒邊緣效應
使用96孔板的ELISA測定中，常發現有“邊緣效應”，即外周孔顯色較中心孔深。經研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實驗室的常規ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。
8.顯色
顯色一定要控制時間，根據試劑盒說明操作即可。一般來說，顯色時間過短，結果偏低;顯色時間過長，空白增高或者非特異性顯色增加。
9.比色
比色要注意波長的選擇。以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據要求隨時更換。因此，容易出現濾光片錯用的問題。
其次，單波長或雙波長比色選擇的問題。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定;而雙波長雙色則酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和;非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。